Gene therapy for congenital muscular dystrophies

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Using gene therapy to treat multiple dystrophies

Congenital Muscular Dystrophy Type 1A (MDC1A) is caused by mutations in the Lama2 gene that cause muscle wasting and destruction of the protective myelin coating around the peripheral nerves. CRISPR has already shown positive preclinical results in Duchenne muscular dystrophy, mainly by targeting mutations in the gene that produces dystrophin, a protein essential for muscle support. Ronald Cohn and his colleagues at Toronto's Hospital for Sick Children (SickKids) used earlier CRISPR-cas9 to eliminate dysfunctional dystrophin exons (inclusion-exon strategy), leaving a shortened but still functional gene. The therapy has been effective for more than a year in mice. In another study researchers applied CRISPR to target exon 51 and successfully restored dystrophin levels to 92% of normal in models of Duchenne muscular dystrophy in dogs.

The problem of the heterogeneity of muscular dystrophies

There are more than 350 nonsense pathogen, missense, splice site and deletion mutations in LAMA2 reported to date.One of the problems in developing a therapy for the treatment of MDC1A is that the heterogeneity of the mutations often leads to varying severity and progression of the disease. Therefore, it is urgent to develop a universal, mutations-independent strategy that offers a therapeutic approach to all patients with MDC1A.

How to extend the application range of CRISPR-Cas9?

Given the number of genomic alterations causing MDC1A, the Crispr-Cas9-mediated correction would require the design and in-depth analysis of several single-guide RNAs (sgRNAs) specific to each mutation, which means that as many therapies of this type should be designed and evaluated thoroughly for each mutation. In addition, safety concerns regarding the potential mutagenic nature of the CRISPR-Cas9 system and the presence of non-targeted effects after gene editing remain, which together may be difficult from the point of view of safety and security. regulation.

A recent study has described the use of the CRISPR transcription activation system to induce expression of target genes in skeletal, renal and hepatic tissues, resulting in a phenotypic increase such as increased muscle mass and improvement. substantial pathophysiology of the disease. However, it relied almost exclusively on a transgenic mouse model expressing Cas9 or on local intramuscular treatments and so it is difficult to extrapolate the efficacy of this strategy to models relevant to the disease.

On the other hand, attenuation of disease pathogenicity by targeted modulation of disease-modifying gene expression would be a potentially safer and more beneficial alternative for all individuals with MDC1A.

An indirect strategy to address all congenital muscular dystrophies

Neuromuscular diseases have provided excellent examples for demonstrating the role of disease modifiers. One of the most potent disease modifiers reported for MDC1A is laminin 1, which is structurally similar to laminin 2. However, laminin 1 is not expressed in skeletal muscle or Schwann cells.

Previous studies have demonstrated that overexpression of transgenic Lama1 healed from myopathy and peripheral neuropathy in mouse models.

Although these studies established a compensation function for laminin 1 in MDC1A, the use of this modifier as postnatal genomic therapy is hampered by the size of the Lama1 cDNA, which exceeds the packaging capacity of AAV vectors. CRISPR-Cas9 technologies have offered opportunities for regulating gene expression and creating epigenetic alterations without introducing double-strand breaks in DNA, known as the CRISPR transcription activation system.

The strategy uses nuclease-deficient Cas9 (dCas9), which is unable to cut DNA due to mutations in the nuclease domains and retains the ability to specifically bind to DNA when guided by sgRNA.

CRISPR activation uses modified versions of dCas9, a mutation of Cas9 without endonuclease activity, with added transcriptional activators on dCas9 or the guide RNAs (gRNAs). Like a standard CRISPR-Cas9 system, dCas9 activation systems rely on similar components such as Cas9 variants for modulation or modification of genes, gRNAs to guide Cas9 to intended targets, and vectors for introduction into cells. However, while a standard CRISPR-Cas9 system relies on creating breaks in DNA through the endonuclease activity of Cas9 and then manipulating DNA Repair mechanisms for gene editing, dCas9 activation systems are modified and employ transcriptional activators to increase expression of genes of interest.

Using previously described Streptococcus pyogenes (Sp dCas9) fused to multiple copies of the VP16 transcription enhancer, Canadian and other researchers have demonstrated the use of the CRISPR-dCas9 system to positively regulate the expression of the modifying genes. vitro.

When the load is too big for viral vectors

A major challenge for in vivo applications is the large size of Sp dCas9 and its derivatives, which exceed the packaging capacity of the AAV genome. Targeting Lama1 presents a particular challenge: the gene is too large to be contained in the viral vectors traditionally used to administer gene therapy. To account for this limitation, the researchers adapted the transcriptional regulatory system and used a considerably smaller Cas9 protein, derived from mStaphylococcus aureus (Sa 9), to positively regulate Lama1.

What results were obtained?

By increasing the expression of Lama1, the treatment not only prevented paralysis in pre-symptomatic mice, but also reversed the progression of the disease in previously symptomatic animals. The treatment resulted in a reduction of fibrosis and an increase in the size of the muscle fiber, thus preventing the appearance of symptoms. More importantly, in mice already suffering from paralysis, the treatment also allowed the animals to get up and move. The researchers also observed a significant increase in nerve conduction velocity, showing a restoration of the myelin sheath and an improvement in neuromuscular function.

Application to Duchenne muscular dystrophy

The Cohn team believes that its strategy of using the CRISPR provided by AAV to upregulate Lama1 could also be applied to Duchenne muscular dystrophy. To achieve greater efficiency, the system could be used in combination with another technology that corrects the mutation. Its application as a combinatorial therapeutic approach, involving simultaneous up-regulation of protective disease-modifying genes and downregulation of harmful genes would represent a new paradigm for reducing disease phenotypes.

Thérapie génique pour les dystrophies musculaires congénitales

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Utilisation d'une thérapie génique pour soigner de multiples dystrophies

La dystrophie musculaire congénitale de type 1A (MDC1A) est causée par des mutations du gène Lama2 qui entraînent une fonte musculaire et la destruction du revêtement protecteur de myéline autour des nerfs périphériques.

CRISPR a déjà donné des résultats précliniques positifs dans la dystrophie musculaire de Duchenne, principalement en ciblant les mutations du gène qui produit la dystrophine, une protéine essentielle au soutien musculaire.

Ronald Cohn et ses collègues de l'hôpital pour enfants malades (SickKids) de Toronto, ont utilisé précédemment CRISPR-cas9 pour éliminer les exons de dystrophine dysfonctionnels (stratégie d'inclusion-exon), laissant ainsi un gène raccourci mais toujours fonctionnel. La thérapie s'est avérée efficace pendant plus d'un an chez la souris.

Dans une autre étude des chercheurs ont appliqué CRISPR à l'exon 51 cible et rétabli avec succès les niveaux de dystrophine à 92% de la normale dans des modèles de la dystrophie musculaire de Duchenne chez le chien.

Le problème de l'hétérogénéité des dystrophies musculaire

L’un des problèmes posés par l’élaboration d’une thérapie pour le traitement de MDC1A est que l’hétérogénéité des mutations conduit souvent à une gravité et à une progression variable de la maladie. En effet il y a plus de 350 mutations non-sens pathogènes, faux-sens, site d'épissage et délétion dans LAMA2 signalées à ce jour. Par conséquent, il est urgent de développer une stratégie universelle, indépendante des mutations, qui offre une approche thérapeutique à tous les patients atteints de MDC1A.

Comment étendre la gamme d'applications de CRISPR-Cas9?

Étant donné le nombre d'altérations génomiques provoquant MDC1A, la correction médiée par Crispr-Cas9 nécessiterait la conception et l'analyse en profondeur de plusieurs ARN à guide unique (sgRNA) spécifiques à chaque mutation, ce qui signifie qu'autant de thérapies de ce type devraient être conçues et évaluées de manière approfondie pour chaque mutation.

De plus, des problèmes de sécurité concernant la nature mutagène potentielle du système CRISPR–Cas9 et la présence d'effets non ciblés après l'édition du gène subsistent, qui, ensemble, peuvent s'avérer difficiles du point de vue de la sécurité et de la réglementation.

Une étude récente a décrit l’utilisation du système d’activation de la transcription CRISPR pour induire l’expression de gènes cibles dans les tissus squelettiques, rénaux et hépatiques, entraînant une augmentation phénotypique telle que l’augmentation de la masse musculaire et une amélioration substantielle de la physiopathologie de la maladie. Cependant, elle s’appuyait presque exclusivement sur un modèle de souris transgénique exprimant Cas9 ou sur des traitements intramusculaires locaux et il est donc difficile d’extrapoler l’efficacité de cette stratégie à des modèles pertinents pour la maladie.

En revanche, l'atténuation du pouvoir pathogène de la maladie par une modulation ciblée de l'expression de gènes modificateurs de la maladie constituerait une alternative potentiellement plus sûre et bénéfique pour tous les individus atteints de MDC1A.

Une stratégie indirecte pour adresser toutes les dystrophies musculaires congénitales

Les maladies neuromusculaires ont fourni d’excellents exemples pour démontrer le rôle des modificateurs de la maladie. L'un des plus puissants modificateurs de la maladie MDC1A consiste en la laminine 1, qui est structurellement similaire à la laminine 2. Toutefois, la laminine 1 n'est pas exprimée dans les muscles squelettiques ni les cellules de Schwann.

Des études antérieures ont démontré que la surexpression de Lama1 transgénique permettait de guérir de la myopathie et de la neuropathie périphérique dans des modèles de souris.

Bien que ces études aient établi une fonction de compensation de la laminine 1 dans MDC1A, l’utilisation de ce modificateur en tant que généthérapie postnatale est entravée par la taille de l’ADNc de Lama1, qui dépasse la capacité d’encapsidation des vecteurs AAV. Les technologies CRISPR – Cas9 ont offert des possibilités de régulation de l'expression des gènes et de création d'altérations épigénétiques sans introduire de cassures double brin dans l'ADN, connues sous le nom de système d'activation de la transcription CRISPR.

La stratégie utilise la Cas9 déficiente en nucléase (dCas9), qui est incapable de couper l'ADN dû aux mutations dans les domaines de la nucléase et conserve la capacité de se lier spécifiquement à l'ADN lorsqu'elle est guidée par un sgRNA.

L'activation CRISPR utilise des versions modifiées de dCas9, une mutation de Cas9 sans activité endonucléase, avec ajout d'activateurs de transcription sur dCas9 ou les ARN guides (ARNg). À l'instar d'un système CRISPR-Cas9 standard, les systèmes d'activation dCas9 s'appuient sur des composants similaires, tels que les variants Cas9 pour la modulation ou la modification de gènes, les ARNg pour guider Cas9 vers les cibles visées et les vecteurs pour leur introduction dans les cellules. Cependant, alors qu'un système CRISPR-Cas9 standard repose sur la création de coupures dans l'ADN via l'activité endonucléase de Cas9, puis sur la manipulation des mécanismes de réparation de l'ADN pour l'édition de gènes, les systèmes d'activation de dCas9 sont modifiés et utilisent des activateurs de transcription pour augmenter l'expression des gènes d'intérêt.

En utilisant le Streptococcus pyogenes (Sp dCas9) décrit précédemment fusionné à plusieurs copies de l'activateur de transcription VP16, les chercheurs Canadiens et d'autres ont démontré l'utilisation du système CRISPR – dCas9 pour réguler positivement l'expression des gènes modificateurs in vitro.

Quand la charge est trop grande pour les vecteurs viraux

Un défi majeur pour les applications in vivo réside dans la grande taille de Sp dCas9 et ses dérivés, qui dépassent la capacité d'empaquetage du génome des AAV. Le fait de cibler Lama1 présente un défi particulier: le gène est trop gros pour être contenu dans les vecteurs viraux traditionnellement utilisés pour administrer une thérapie génique. Pour tenir compte de cette limitation, les chercheurs ont adapté le système de régulation de la transcription et utilisé une protéine Cas9 considérablement plus petite, dérivée de mStaphylococcus aureus (Sa 9), pour réguler positivement Lama1.

Quels résultats ont été obtenus?

En augmentant l'expression de Lama1, le traitement a non seulement prévenu la paralysie chez les souris pré-symptomatiques, mais également inversé la progression de la maladie chez des animaux ayant déjà présenté des symptômes. Le traitement a entraîné une réduction de la fibrose et une augmentation de la taille de la fibre musculaire, empêchant ainsi l'apparition de symptômes. Plus important encore, chez les souris déjà atteintes de paralysie, le traitement a également permis aux animaux de se lever et de bouger. Les chercheurs ont également observé une augmentation significative de la vitesse de conduction nerveuse, montrant une restauration de la gaine de myéline et une amélioration de la fonction neuromusculaire.

Application à la dystrophie musculaire de Duchenne

L’équipe de Cohn pense que sa stratégie consistant à utiliser le CRISPR fourni par AAV pour réguler à la hausse Lama1 pourrait également être appliquée à la dystrophie musculaire de Duchenne. Pour parvenir à une meilleure efficacité, le système pourrait être utilisé en association avec une autre technologie qui corrige la mutation. Son application en tant qu'approche thérapeutique combinatoire, impliquant une régulation à la hausse simultanée de gènes modificateurs de maladie protecteurs et une régulation négative de gènes nuisibles représenterait un nouveau paradigme pour réduire les phénotypes de maladie.

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